Résumé des travaux de recherches


L’épissage des ARN pre-messagers dans la cellule eucaryote est un processus complexe basé sur la reconnaissance coordonnée de multiples signaux (introniques et exoniques) par un ensemble de protéines au sein du spliceosome. Les séquences auxiliaires d’épissage (activatrices ou inhibitrices) situées en dehors des sites consensus d’épissage jouent un rôle déterminant dans la régulation de l’épissage constitutif et alternatif des gènes. L’étude de mutations naturelles conduisant à des anomalies d’épissage en pathologie humaine permet d’orienter les recherches vers les séquences de régulation de l’épissage. Notre groupe est specialisé depuis de nombreuses années dans l’étude des mutations du gène dystrophine.

Notre premier axe de recherche consiste à identifier les différents acteurs, séquences régulatrices et complexes protéiques (facteurs trans) qui président aux choix des sites d'épissage des exons du gène dystrophine dans les conditions normales et pathologiques. Nous avons ainsi identifié les premières séquences activatrices (ESE) et inhibitrices (ESS) qui régulent l’épissage d’un exon du gène dystrophine.

Le deuxième axe de notre recherche vise à développer un système de criblage efficace et rapide permettant de valider in vivo dans un modèle cellulaire des séquences régulatrices d’épissage prédites in silico par des algorithmes développés au laboratoire (Christophe Béroud, Dalil Hamroun, http://www.umd.be/SSF). Deux types de séquences sont principalement étudiées : les séquences de points de branchement (PB) et les séquences exoniques activatrices de l’épissage (ESE, exonic enhancer sequences). Les séquences à tester sont insérées dans un minigène rapporteur fluorescent (GFP) à 3 exons. L’émission de fluorescence GFP, après transfection transitoire des minigènes dans des cellules HeLa, est corrélée au taux d’inclusion de l’exon "test" central dans le transcrit mature. Ce système de criblage permet également d’évaluer l’impact potentiel sur l’épissage de mutations faux-sens identifiées dans les gènes étudiés au laboratoire.

L’identification de séquences cis-régulatrices de l’épissage est d’un intérêt majeur pour le développement des nouvelles stratégies thérapeutiques qui visent à modifier l’épissage (saut d’exon ou ré-inclusion d’exon) grâce à l’utilisation d’oligonucléotides antisens dirigés contre des séquences cibles de l’ARN. La thérapie par saut d’exon est l’une des voies majeures de thérapie en cours d’évaluation pour corriger les mutations du gène dystrophine responsables des myopathies de Duchenne et de Becker.


Techniques

Etude et quantification des transcrits musculaires, construction de minigènes à 3 exons, PCR overlap, mutagénèse dirigée, analyses bioinformatiques, interactions ARN-protéines in vitro (UV-cross linking), épissage in vitro, transfections transitoires ou stables dans des cellules eucaryotes, microscopie par fluorescence, FACS,  branch-point mapping, construction de vecteurs d’expression de facteurs d’épissage (protéines SR, hnRNPs), RNAi.


Responsable : Sylvie Tuffery-Giraud, PhD

sylvie.tuffery@montp.inserm.fr


Equipe

Sandie Le Guédard-Mereuze, doctorant

Mouna Messaoud Khelifi, doctorant

Launch the english version


Publications majeurs


Beroud C, Tuffery-Giraud S, Matsuo M, Hamroun D, Humbertclaude V, Monnier N, Moizard MP, Voelckel MA, Calemard LM, Boisseau P, Blayau M, Philippe C, Cossee M, Pages M, Rivier F, Danos O, Garcia L, Claustres M.

Multiexon skipping leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Mutat. 2007 Feb;28(2):196-202.


Disset A, Bourgeois CF, Benmalek N, Claustres M, Stevenin J, Tuffery-Giraud S.

An exon skipping-associated nonsense mutation in the dystrophin gene uncovers a complex interplay between multiple antagonistic splicing elements.

Hum Mol Genet. 2006 Mar 15;15(6):999-1013. Epub 2006 Feb 6.


Leroy O, Dhaenens CM, Schraen-Maschke S, Belarbi K, Delacourte A, Andreadis A, Sablonniere B, Buee L, Sergeant N, Caillet-Boudin ML.

ETR-3 represses Tau exons 2/3 inclusion, a splicing event abnormally enhanced in myotonic dystrophy type I.  J Neurosci Res. 2006, 84(4):852-9.


Hnia K, Tuffery-Giraud S, Vermaelen M, Hugon G, Chazalette D, Masmoudi A, Rivier F, Mornet D.

Pathological pattern of Mdx mice diaphragm correlates with gradual expression of the short utrophin isoform Up71. 

Biochimica Biophysica Acta, 2006, 1762, 362-372.


Tuffery-Giraud S, Saquet C, Thorel D, Disset A, Rivier F, Malcolm S, Claustres M.

Mutation spectrum leading to an attenuated phenotype in dystrophinopathies. 

Eur J Hum Genet. 2005, 13(12):1254-60.


Disset A, Michot C, Harris A, Buratti E, Claustres M, Tuffery-Giraud A.

T3 allele in the CFTR gene exacerbates exon 9 skipping in vas deferens and epididymal cell lines and is associated with Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens (CBAVD). S.

Hum Mutat, 2005, 25:72-81.


Tuffery-Giraud S, Saquet C, Chambert S, Echenne B, Cuisset JM, Rivier F, Cossée M, Philippe C, Monnier N, Bieth E, Recan D, Voelckel MA, Perelman S, Lambert JC, Malcom  S, Claustres M.

The role of Muscle Biopsy in Analysis of the Dystrophin Gene in Duchenne Muscular Dystrophy: Experience of a national referral centre.

Neuromuscular Disord. 2004, 14: 650-658.


Tuffery-Giraud S, Saquet C, Chambert S, Claustres M.

Peudoexon activation in the DMD gene as a novel mechanism for Becker muscular dystrophy.

Hum Mutat. 2003, 21:608-614.