Les expérimentations préalables à un DPI moléculaire
Pour chaque maladie : mise au point d'une stratégie moléculaire
Avant toute application clinique, les protocoles de PCR et d'analyse post-PCR choisis pour chaque maladie monogénique proposée en DPI doivent être rigoureusement mis au point et optimisés sur des centaines de cellules qui ont été isolées une à une sous un microscope (lymphocytes, lymphoblastes ou fibroblastes), puis soumises à des tests génétiques afin de déterminer, pour chaque séquence génomique étudiée, les taux d'amplification et d'ADO.
Ces travaux préparatoires nécessitent plusieurs mois d'expérimentations en fonction des caractéristiques associées aux séquences analysées et des techniques préanalytiques et analytiques choisies pour chaque cas. Le diagnostic d'une maladie monogénique ne devrait être appliqué en DPI que si le taux d'amplification est supérieur à 90% et si le taux d'ADO est inférieur à 10% au niveau des cellules isolées testées. Cependant, la qualité du matériel génétique des blastomères est variable, parfois médiocre, et malgré l'optimisation préalable des protocoles, il arrive que le taux d'échec d'amplification ou le taux d'ADO soit ponctuellement élevé.
Chaque laboratoire a donc développé diverses procédures afin d'être en mesure de détecter le phénomène d'ADO. La stratégie la plus efficace est de combiner le diagnostic génotypique direct (recherche de la mutation par diverses techniques) et indirect (étude de l'haplotype lié au gène sain et de l'haplotype lié au gène muté). La PCR multiplex (plusieurs cibles du gène sont amplifiées simultanément) combine l'amplification de l'allèle normal ou muté et l'amplification de divers marqueurs polymorphes situés à proximité de la zone mutée ou du gène impliqué dans la maladie. La technique de PCR nichée [deux PCR successives, la deuxième utilisant des amorces internes par rapport à celles utilisées dans la première] permet d'augmenter l'efficacité et la spécificité de la réaction d'amplification ; cependant elle alourdit considérablement le protocole.
Pour de nombreuses maladies à forte hétérogénéité allélique, il est impossible de consacrer des mois de mise au point pour chaque mutation, d'autant que certains types de mutations (par exemple les grands réarrangements) sont inaccessibles au génotypage unicellulaire. Dans ces cas, seule l'analyse indirecte basée sur la ségrégation de marqueurs polymorphes de l'ADN est utilisée.
Pour chaque couple: optimisation de la stratégie ?
En amont des DPI, chaque dossier doit être expertisé : nous devons vérifier la présence, la position et la nomenclature de chaque allèle muté qui a été identifié dans un autre laboratoire.
Ces vérifications impliquent de nouveaux prélèvements de sang des parents et du cas index et une ré-analyse systématique de leurs caractéristiques génétiques. Grâce à cette démarche de qualité, nous avons pu déceler déjà plusieurs erreurs de génotypage, dont les conséquences auraient pu être dramatiques si elles n'avaient pas été détectées. Cela alourdit évidemment les procédures, mais cette étape est indispensable et doit être prise en compte dans l'évaluation des besoins en techniciens et en biologistes.
L’inclusion de chaque nouveau couple dans un protocole de DPI nécessite non seulement leur ré-analyse préalable mais aussi parfois le développement de nouveaux protocoles diagnostiques adaptés à leurs caractéristiques génétiques, en particulier au niveau des marqueurs polymorphes (certains couples par exemple ne présentent pas une informativité suffisante pour des combinaisons de marqueurs mises au point pour la majorité des couples concernés par telle maladie). Dans ces cas, il faut à nouveau isoler un à un des centaines de lymphocytes à partir d'un prélèvement de chaque membre-clé de la famille et remettre au point de nouvelles PCR multiplex.